血細胞分離技術(shù)

采血

（一）材料與試劑

1．抗凝劑
（1）肝素：肝素是含硫酸基的粘多糖，常用其鈉鹽或鉀鹽，它能阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，進而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白，從而阻止血液凝固。常用的肝素溶液濃度為1 000U/ml，市售肝素多為100U~126U／mg。
（2）乙二胺四乙酸（EDTA）：是一種螯合劑。用生理鹽水配制成4％的溶液備用。
（3）阿氏液（Alsever液），配方如下：
枸櫞酸鈉（Na3C6H5O7·5H2O） 0.80g
枸櫞酸 0.0325g
葡萄糖 2.05g
氯化鈉 0.42g
H2O 加至 100.00ml
混勻溶解后，114.3℃高壓蒸汽滅菌10min備用。
阿氏液中既含有枸櫞酸鈉抗凝劑，又含有細胞生存的營養(yǎng)，所以它既可做抗凝劑，又可做血細胞的保存液。
2．針頭 根據(jù)不同動物和采血部位，采用不同型號的針頭，用前必須滅菌或消毒。
3．采血容器 注射器或三角瓶等。
4．采血動物。

（二）操作方法
1．采血法 各種動物采血方法不一。馬、牛、羊等大動物一般從頸靜脈采血，豬從頸靜脈、前腔靜脈或耳靜脈采血，家禽由翼下靜脈或心臟采血，兔由心臟或耳靜脈采血，犬由頸靜脈或四肢靜脈采血，豚鼠由心臟采血，小白鼠則可斷尾或剪斷腋下血管或剪斷眼球采血。
2．抗凝 采集血液zui關(guān)鍵的問題是抗凝，采用什么方法進行抗凝，則根據(jù)實驗的要求和條件而定。zui常用的方法如下：
（1）肝素抗凝：采血時，使每ml血液含15U~20U肝素即可。計算采集的血液量，按1 000U/ml的量加入肝素，直接放入采血容器中，采血時，邊采血邊輕輕搖動，使抗凝劑和血液混勻。對于采少量的血液或小動物采血，可直接用注射器抽取一定量的肝素液，再采血直接抗凝。
（2）EDTA抗凝：采血前，用滅菌生理鹽水將EDTA配制成4％溶液，然后按預采血液的量，以每ml血液加入1mg~2mg的EDTA的液體量于采血容器內(nèi)。采血，并不斷搖動采血容器，使之混勻。
（3）玻璃珠法：預先將適量的玻璃珠（根據(jù)采血量多少而定）清洗后，裝入采血容器中，滅菌后備用。采血過程中，邊采邊搖采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滾動，以機械地除去纖維蛋白，使血液不能凝固。本法雖較麻煩，但對淋巴細胞的活性影響zui小，且可減少血小板的混雜。
（4）阿氏液采血：以阿氏液和采血量以1︰1比例采集血液，邊采邊輕輕搖動采血瓶，使之混勻。用阿氏液采血，除了抗凝外，多用于紅細胞的保存。一般在4℃條件下，阿氏液中保存的紅細胞2周其活性和特性不變。

紅細胞的分離技術(shù)

（一）材料與試劑

1．肝素等抗凝劑
2．3％明膠液 取明膠3g，溶于0.9％滅菌鹽水100ml中，114.3℃滅菌10min，冷卻后4℃冰箱保存。臨用時，37℃預熱10min。
3．阿氏液

（二）操作方法
1．采血抗凝，即為紅細胞。由于紅細胞與白細胞的比例相差懸殊，一般白細胞混雜在其中，忽略不計。
2．根據(jù)紅細胞的用途，可做進一步的處理。如計算紅細胞，可直接稀釋計數(shù)。如需做補體結(jié)合反應，或其它溶紅細胞反應，則需將紅細胞進行充分的清洗，以除去附著在紅細胞膜表面的血漿。一般用等滲的稀釋液連續(xù)清洗，2 000r/min離心10min，重復3~4次。
3．如需儲藏備用，則以阿氏液做抗凝劑采血，混勻后置4℃冰箱保存，可保存2周，其活性尚可。

淋巴細胞的分離技術(shù)

（一）材料與試劑
1．淋巴細胞分層液有兩種：
（1）聚蔗糖—泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrose solution）,商品名Ficoll，分子量400 000，多配制成40±1％（W/V）水溶液，也有干粉出售。應用時，用蒸餾水配制9％溶液。泛影葡胺溶液（Meglumini diatrizoici），商品名Vrografin，結(jié)構(gòu)式為3，5—二乙酰氨基2，4，6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。含量為60％或75％，每安瓶為20ml裝，常用于人的臟器造影。應用時，取60％泛影葡胺原液20ml，加雙蒸餾水15.38ml，即為33.9％泛影葡胺。

1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制：
9％聚蔗糖液 24份
33.9％泛影葡胺液 10份
混合即可。必要時，可測比重。需要備用，可用G5漏斗過濾除菌或114.3℃高壓滅菌15min，4℃保存。一般可保存3個月。
如要配制不同比例的分層液，可按下列公式計算：
式中dm為分層液的比重，d1和d2分別為9％聚蔗糖和33.9％泛影葡胺的比重，V1和V2分別為它們的體積。如需配制1.077比重的聚蔗糖—泛影葡胺的分層液，則9％的聚蔗糖和33.9％的泛影葡胺的比例應為100︰46.3。
（2）泛影葡胺—右旋糖酐（dextran）液
34％泛影葡胺液 10份
60％右旋糖酐液 12.5份
混合，即為比重1.07～1.09的分層液。分裝于棕色瓶中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br />
2． 3％的明膠液 稱取明膠3g，溶于0.9％的滅菌生理鹽水，終體積100ml，114.3℃高壓滅菌10min，冷卻后4℃冰箱保存，臨用時37℃預熱10min。

3．Hank’s液。
（二）操作方法
1．取抗凝血，自然沉降，如是馬屬動物的血液，可直接直立試管架上，讓其自然沉降1h，取上層血漿。如是牛、羊血液，由于其血沉速度非常慢，可加等量3％明膠液，混勻后讓其自然沉降，1h后取上層血漿。
2．2 000r/min離心10min，棄上清。
3．沉淀用Hank’s液混懸后，再2 000r/min離心10min。
4．重復步驟3一次，再用細胞營養(yǎng)液將白細胞制成懸液。此液含有整個白細胞群，包括粒細胞、淋巴細胞、單核細胞和部分紅細胞?？晒┌准毎嫈?shù)用。
5．取2ml細胞分層液于離心管內(nèi)，同時用毛細吸管吸取約2ml的血漿（自然沉降1h的上層血漿）輕輕加入分層液上，直接加抗凝血也可。
6．以水平轉(zhuǎn)子離心機2 000r/min離心20min。離心后，可見分成多層，zui下層是紅細胞，中間層是分層液，zui上層是血漿。在血漿層與分層液之間是一薄層較致密的白色層，即為單個核細胞層。
7．用毛細吸管插入到單個核細胞層并吸取該層，放入另一試管中。
8．以Hank’s液洗滌、離心，zui后配制成適當?shù)陌准毎麧舛取１匾獣r可計數(shù)。

（三）注意事項
1．血漿或血液加入分層液中時要小心，緩慢不要打亂液層、不要搖動。也可以將分層液加入到血漿的上層。
2．保持淋巴細胞的活性是非常重要的，所以一般情況下，是現(xiàn)采血，馬上進行分離。
3．經(jīng)過分層液分離的淋巴細胞層，實際上是單個核細胞層，包括單核細胞，不包括粒細胞。欲分離出純的淋巴細胞，則按下法除去單核細胞，或收獲單核細胞。

T淋巴細胞的分離技術(shù)

（一）原理
混合單個核細胞懸液在通過尼龍毛柱時，B細胞、漿細胞、單核細胞和一些輔助細胞被選擇性粘附于尼龍毛上，而多數(shù)T細胞則通過尼龍毛柱，這是獲得富含T細胞群的有效方法。

（二）材料及試劑
1．尼龍毛（Femwall Laboratories,LP－1 Leukoqak leukocyte Filters）。
2．燒杯、鋁箔、漏斗、一次性手套等。
3．裝填尼龍毛柱，一次性注射器。
4．取自然沉降的上層血漿，過聚蔗糖—泛影葡胺分層液后，獲取的血漿和分層液之間的單個核細胞層。

（三）操作方法
1．尼龍毛的清洗與干燥
（1）戴上已經(jīng)洗去滑石粉的一次性手套，將尼龍毛（1包或2包，每包35g）放入燒杯中，加入蒸餾水或去離子水，用鋁箔蓋上燒杯并煮沸約10min。
（2）冷卻至常溫，倒入漏斗內(nèi)，使水滴干。
（3）重復（1）、（2）步驟6次。
（4）將尼龍毛攤在鋪有紗布的方盤內(nèi)，37℃溫箱干燥2～3天后，貯藏在帶蓋的方盤內(nèi)。

2．裝尼龍毛柱
（1）取50ml玻璃注射器，拔去注射芯，在注射器頭上套一段帶夾子的膠管。
（2）將尼龍毛梳理，并適當折疊，以適應注射器的直徑，填入注射器內(nèi)，約20ml的體積。
（3）將填好尼龍毛的注射器連同注射器芯一起包好，高壓滅菌。

3．細胞分離
（1）將注射器固定在支架上，倒入37℃的細胞培養(yǎng)液，關(guān)閉閥門一定時間，然后打開閥門，放掉細胞培養(yǎng)液，以清洗幾次尼龍毛，關(guān)上閥門。
（2）將要分離的細胞液用預先加溫的培養(yǎng)液稀釋成適當?shù)臐舛?，約5.00×107個細胞／ml。
（3）將細胞液倒入注射器內(nèi)，使之沒過尼龍毛柱。蓋上注射器，37℃溫育45min
至1h。
（4）打開下口，緩慢放流（1滴／min），收集于離心管中。
（5）離心，即獲所需的T淋巴細胞。
（6）關(guān)閉注射器下口，于注射器內(nèi)加入0.85％冰冷生理鹽水，振蕩，并套上注射器芯，打開下口，使勁推出注射器內(nèi)液體，即獲得粘附于尼龍毛上的B淋巴細胞、漿細胞、巨噬細胞等。
（四）注意事項
1．此種分離法，T淋巴細胞也常有一部分被吸附，吸附的多少與尼龍毛的質(zhì)量有關(guān)，與裝柱的松緊也有關(guān)系。
2．此法的T淋巴細胞的回收率約20％～30％。
3．用過的尼龍毛可回收，以鹽水洗滌，然后浸入0.1Mol/L的HCl中過夜，然后再同前法清洗。

單核細胞分離技術(shù)

（一）鐵粉吸附法
1．材料及試劑
（1）鐵粉或羰基鐵粉（Atomergic chemetals）99％的純度，顆粒小于60µm（Goodfellow Metals）。
（2）強磁鐵（馬蹄形）。
（3）一塊小棒狀磁鐵（約1cm長）。
（4）毛細吸管等。
2．操作方法
（1）稱取一定量的鐵粉，一般為10g，用100ml生理鹽水洗滌4次，去除任何可溶性有毒物質(zhì)。在倒去鹽水時，用強磁鐵吸住鐵粉。
（2）用50ml生理鹽水混懸鐵粉。搖勻后，分裝于10個瓶中，包扎瓶口，121℃滅菌20min，拿出后立即輕輕搖勻，防止鐵粉結(jié)塊，儲藏備用。
（3）臨用前，倒去瓶中的生理鹽水，加入適量的單個核細胞懸液（3ml～5ml，細胞總數(shù)為8×107個／瓶）。37℃溫育45min，中間不時晃動，使鐵粉懸浮起來。
（4）加入一塊小磁鐵棒于瓶中，讓其吸住鐵粉以及附著在鐵粉上的細胞。
（5）倒出懸液，此懸液主要是淋巴細胞，離心，收集。
（6）在鐵粉瓶內(nèi)倒入一定量的Hank’s液，用力振搖后，以強磁鐵吸附，幾分鐘后，倒出液體。
（7）2 000r/min離心液體，管底即為單核細胞。

（二）玻璃板吸附法
將分離的單個核細胞傾于無菌潔凈的玻璃平皿內(nèi)，置37℃ 30 min～40min，用毛細吸管輕輕吸取懸液，即為淋巴細胞。用適量的Hank’s液沖洗平皿，收獲即為單核細胞懸液。